Období nacistické okupace představovalo pro ústav těžké období: čelil největší kapacitní krizi a do vedení byl dosazen Němec Johann Jurek, který se měl podílet na vyhlazení Lidic. Krizi vyvolalo hromadné rušení obdobných zařízení v zemi a uzavření tří tuberkulózních pavilonů v nemocnici na Bulovce. Pacienti odtud byli přemisťováni právě do Bohnic.
Od roku 1939 působil v ústavu odboj z řad opatrovníků a později jejich potomků, který lidem pronásledovaným nacisty poskytoval útočiště jako fiktivním pacientům a podporoval jejich rodiny. Z první vlny odboje byli všichni odhaleni a posláni na smrt do Osvětimi.
Věž kostela sv. Václava, jeden z nejvyšších bodů v tehdejší Praze, sloužila spojeneckým armádám jako orientační bod pro letecké útoky, a proto okupanti uvažovali o jejím zbourání.
Během květnového povstání v roce 1945 přišli o život tři zaměstnanci ústavu. Jejich jména jsou uvedena na pamětní desce v ústřední budově.
